GenExact™ 一本鎖DNA

CRISPRベースの遺伝子挿入、置換および修正

HDRベースのCRISPR遺伝子編集のメカニズム

CRISPR/Cas9は、ターゲットDNA部位へ正確に二本鎖切断（DSBs）を行うため、広く普及しています。ガイドRNA（gRNA）はCas9タンパク質と複合体を形成した後、ターゲットDNA上のprotospacer adjacent motif（PAM）配列を認識します。Cas9は、エンドヌクレアーゼ活性によりDSBsを引き起こし、その後2種類の修復機構を誘導します。一つは非相同末端結合（NHEJ: non-homologous end-joining）で、DSB部位に変異を導入します。もう一方のメカニズムは相同組換え修復（HDR: homology directed repair）で、切断部位にドナーDNAを挿入し、遺伝子ノックインを可能にします。従来、HDR用のドナーDNAテンプレートとして、二本鎖DNA（dsDNA）使用されてきましたが、最近の研究では、一本鎖DNA（ssDNAまたはssODN）がCRISPRベースの遺伝子挿入、置換及び修正で最適なHDRテンプレートであることが示されました1-5。

関連文献

二本鎖DNAドナーと比較して、一本鎖DNAでは、特にプライマリー細胞、幹細胞およびトランスジェニック動物モデルの開発において、ゲノム編集効率や特異性の向上、およびオフターゲットの減少が証明されています^1-5。

• 1."We recently demonstrated that long single-stranded DNAs (ssDNAs) serve as very efficient donors, both for insertion and for gene replacement." Miura H, et al., Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. (2018) 13(1):195-215.
• 2."We report that targeted chromosomal translocations are generated more efficiently when the all-in-one plasmid, RNP complex, and ssODN-based approaches are used, with the most efficient strategy being the combination of RNP complexes with translocation-ssODNs." Torres-Ruiz, et al., Efficient Recreation of t(11;22) EWSR1-FLI1+ in Human Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Stem Cell Reports. (2017) 8: 1408–1420.
• 3."ssDNA templates have a unique advantage in terms of repair specificity while dsDNA donors can lead to a high rate of off-target integration." Li, et al., Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in. bioRxiv 178905; doi: https://doi.org/10.1101/178905.
• 4."The PITCh approach required 265 zygotes whereas Easi-CRISPR used only 105 zygotes, and the PITCh approach produced 33% correctly targeted pups, whereas Easi-CRISPR (using ssDNA donors) produced 100% correctly targeted pups." Quadros, et al., Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology (2017) 18:92.
• 5."Similar to what has been described with viral HDR templates, we found evidence to suggest that double-stranded templates could integrate independent of target homology, albeit at low rates. These rare events could be reduced almost completely by using single-stranded DNA (ssDNA) templates." Roth, et al., Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559 (2018) 405–409.

• 1) CRISPRを介した遺伝子ノックアウトを実施する際、様々なHDRテンプレートからどのように選択しますか？dsDNA、プラスミドDNA、またはssDNAを選択するべきですか？

  実験目的、および宿主細胞株によります。二本鎖DNAドナーと比較して、一本鎖DNAでは、特にプライマリー細胞、幹細胞およびトランスジェニック動物モデルの開発において、ゲノム編集効率や特異性の向上、およびオフターゲットの減少が証明されています。

  	Plasmid DNA	dsDNA	ssDNA
  HDR efficiency	Medium	High	Comparable to dsDNA
  Off-target rate	Medium	High	Low
  Cost	Lower	Medium	High
  Toxicity	High	High	Low

• 2) 効果的なssDNAテンプレートをデザインする秘訣は何ですか？

  点変異には非対称ssDNAのデザインを使用することが提唱されています。その他のデザインの秘訣は、こちらの論文をご覧ください。長鎖遺伝子の挿入は、挿入遺伝子に300～1000 bpのホモロジーアームを付与したものが報告されています。多くの場合、500 bpのホモロジーアームが使用されています。二回目以降の切断を避けるため、ssDNAテンプレートはＰＡＭ配列にサイレント変異を含むようデザインすることが重要です。ノックインドナーデザインは複雑になることがあります。ソフトウェアを使用して（例．snapgene）、配列を表示・編集することを強く推奨します。

• 3) ssDNAをデザインする際、テンプレートDNAのホモロジーアームはどれくらいの長さが良いですか？

  挿入遺伝子に300～1000 bpのホモロジーアームを付与したものが報告されています。多くの場合、500 bpのホモロジーアームが使用されています。

• 4) CRISPRのノックイン効率を向上させる秘訣は？
  • お客様のsgRNAを慎重にデザインすることです。sgRNAの切断部位は突然変異部位に近くする必要があり、15 bp以内にデザインすることが最善です。
  • gRNA/Cas9およびドナーテンプレートのトランスフェクション前に、トランスフェクション効率を最適化してください。
  • トランスフェクションした細胞を、フローサイトメトリーによるソーティングで濃縮してください。
  • 可能であれば、薬剤またはマーカーでノックインクローンを選択してください（例. 選択用に、挿入遺伝子C末端にピューロマイシン耐性遺伝子をタグ付けする）。
  • その他の情報は、「Strategies to Efficiently Generate CRISPR KO/KI Cell Lines」 についての、GenScriptのウェビナーをご覧ください。
• 5) マウスでコンディショナルアレルを生成する秘訣は？

  マウスにおいてCRISPR/Cas9を介したヌルアレル作成は非常に効率的ですが、コンディショナルアレル作成はより難しいことが証明されています。

  • HDR効率はCas9の切断効率と大きく関連しており、sgRNAsの慎重なデザインと選択で向上できます。
  • オフターゲット減少のため、dsDNAよりも長鎖ssDNAの使用を推奨します。
  • LoxP配列導入によるコンディショナルアレル作製の際、二本の短鎖ssDNAsを使用するよりも一本の長鎖ssDNAを使用するほうが効率的です。
• 6) トランスフェクションした細胞で、HDR効率が低かった場合、どのように対処しますか？

  問題の特定と解決のため、以下のワークフローを参照してください。

  
• 7) GenScriptが作成するssDNAの最大の長さはどれくらいですか？

  GenScriptでは、3000 nt未満の長さの配列は日常的に作成しています。当社は過去に、GC含量とリピート配列が非常に多いモチーフを持つ最大5000 ntのssDNA合成に成功しています。3000 ntよりも長いssDNAの合成をご希望の場合、当社の技術サポートチームまでご相談ください。

• 8) GenScriptが提供する最大量はどれくらいですか？

  GenScriptがお届けする最大量は、配列の長さが< 1 kbの場合は40 µg、1-3 kbの場合は20 µg、>3 kbの場合は最大収量が5 µgとなります。

• 9) ssDNAテンプレートに行う品質管理試験は何がありますか？

  当社は凍結乾燥前の最終ssDNA産物に、二つの主な品質管理試験を実施します: 1) ssDNAの配列を保証するためのサンガーシークエンシング; 2) ゲル電気泳動による最終ssDNA産物の純度試験。

• 10) 最終ssDNA産物を含めて、なぜ二回のシークエンシングを行うのですか？

  ssDNAの生産中、当社では配列精度の保証のため、二回のシークエンシングを行います。まず最初に、プラスミドDNAテンプレートに対してシークエンシングを行い、配列に間違いがないか検証します。さらに、最終ssDNA産物に対してもダイレクトシークエンシングを行い、ssDNA製品の同一性を確認しています。

• 11) 最終ssDNA産物をどのように精製していますか？

  高収率かつ高純度、および化学物質の混入を防ぐため、当社は磁気ビーズとアガロースゲル精製の利点を組み合わせた方法を用いています。

• 12) ssDNA産物へのdsDNAの混入を心配する必要はありますか？

  必要ありません。最終ssDNA産物は、配列検証済のssDNA分子のみを含んでいます。GenScriptは、当社独自・特許取得済みの合成酵素アプローチにより、当社のssDNA製品はdsDNAが検出できないレベルであることを保証しています。

• 13) ＣＯＡレポートのゲル画像に、バンドが一本以上あるのはなぜですか？

  いくつかのssDNA産物は、その本来のヌクレオチド配列により、強い凝集傾向を持つ事があります。これらの凝集は分子内および／または分子間力によって形成されることがあります。

  ゲル画像内の余分なバンドがssDNAの凝集またはdsDNAの混入かを試験するため、dsDNAは分解せずにssDNAを分解する、S1ヌクレアーゼを使用した消化試験の追加可能です。ssDNA産物が100%の純度であればdsDNAが含まれないため、全てのサンプルはS1ヌクレアーゼで消化され、ゲル電気泳動を行った後にバンドが確認されなくなります。逆に、ssDNA産物にdsDNAが混入している場合、S1ヌクレアーゼの添加後も完全には消化されず、ゲル画像上にバンドが現れたままとなります。

  

  追加実験として、他のバンドがssDNA凝集物であるか確認するために、ゲル上のssDNAのバンドを切り出し、二回目のゲル電気泳動を実施しすることも可能です。目的サイズ以外のバンドがssDNA分子の凝集物である場合、精製後のゲル電気泳動でも現れてきます。さらに、ssDNAバンドの比率は、二つのゲルの間で同様のままとなります。