概要

CRISPR gRNAのプールライブラリーは、ターゲット分子のハイスループットスクリーニングに最適です。このライブラリーを使用することにより、CRISPRによるゲノム編集において、遺伝子発現や転写活性化因子のノックアウトを効率的かつ特異的に行うことができます。

GenScriptは、ヒトおよびマウスの遺伝子をゲノムワイドにノックアウトするGeCKOライブラリーや、ヒトやマウスのゲノム上の各遺伝子の転写を活性化するCRISPR Synergistic Activating Mediator (SAM)ライブラリーなど、Broad Institute検証済みの様々なgRNAライブラリを用意しています。

また、当社ではCRISPRノックアウト、CRISPRaおよびCRISPRi用に、完全なカバレッジと均一な分布を持つ、完全カスタマイズしたgRNAライブラリも提供しています。

どのようにCRISPRライブラリーは使用される?

CRISPR技術を使用したスクリーニングは、その簡便性、特異性、汎用性に優れていることから極めて有用です。ゲノムワイドのGeCKOおよびSAMライブラリーは、ヒトまたはマウスの全遺伝子をターゲット(各遺伝子をノックアウトもしくは転写活性化)するようにデザインされています。 ライブラリーは増幅、パッケージングおよび宿主細胞に導入され、変異細胞株が作製されます(図1)。次に、この変異体は、ポジティブまたはネガティブセレクションのような特定の条件の下でスクリーニングし、パスウェイにおける重要な遺伝子変異を特定することができます。

図1:CRISPR gRNAライブラリの使用法

CRISPR gRNA library

CRISPR gRNA Libraries

  • カスタムgRNAライブラリ – お客様のスクリーニング能力を最大化

    当社独自のアレイ化された、半導体ベースの高品質なオリゴヌクレオチド合成プラットフォームを用いて、GenScriptはCRISPRノックアウト、CRISPRaおよびCRISPRi用の完全なカバレッジと均一な分布を持つ、フルカスタマイズしたgRNAライブラリを提供しています。

    利点:

    • 最高のライブラリーカバレッジ:NGS解析で >99%のカバレッジ
    • Feng Zhang研究室よりライセンスされたデュアルまたはオールインワンCRISPRベクター、あるいはカスタムベクターへのクローニング
    • フレキシブルな量(µgからmgレベル)で、ウイルスパッケージングにすぐ使用できるプラスミドフォーマットでお届け
    • 配列制限無し
    • 最短7週間でお届け
    CRISPR gRNA library

    アレイ化された半導体ベースのオリゴヌクレオチドを用いたgRNAライブラリー構築のワークフロー 当社の先進の半導体技術を用いて、最初に一本鎖オリゴヌクレオチドとして精密に合成されます。PCR増幅後、二本鎖gRNAを選択ベクターにクローニングし、スクリーニングライブラリを作成します。通常は、効率的な形質導入のため、高力価ウイルス産生に最適化されたレンチウイルスベクターが使用されます。

    事例:gRNAの100%カバレッジと均一な分布(NGS解析)

    Rank 10% 44
    Rank 90% 206
    Skew (90%/10%) 4.68
    Average Depth 117
    MaxDepth 1068
    Total Oligo 62804
    Sequenced Oligo 62804

    本ケースでは62,804種類の多様なgRNAからなるgRNAライブラリーを構築し、NGS解析によりgRNAライブラリーは100%のカバレッジを示されました。さらに、90/10の割合が5未満であることから、ライブラリー内で目的のgRNAが均等に分布していることが分かり、最大のスクリーニング効率と、「当たり」の同定が保証されています。

  • ゲノムスケールノックアウトのための、GeCKOライブラリー

    ゲノムスケールCRISPRノックアウト(GeCKO)v2ライブラリーは、ヒトやマウスの細胞において、特定のフェノタイプの発生を欠失させる機能欠損変異の迅速なスクリーニングに有用です。GenScriptは、Broad Instituteからのライセンスに基づき、Feng Zhang研究室で開発された8種類のGeCKO v2 CRISPRライブラリーを提供しています。* このライブラリーは、ヒトおよびマウスのゲノムDNAの遺伝子およびmiRNAをターゲットとする各種gRNAをプールしたものです。GeCKO v2ライブラリーにはコントロールとしてnon-targeting gRNAも含まれており、さらに高力価レンチウイルスを産生するために最適化されたレンチウイルスベクターを使用することで、初代培養細胞へのトランスフェクション効率を向上させています。GeCKOライブラリーは、ヒトやマウスの初代培養細胞、幹細胞、癌細胞、安定発現細胞株において使用されています。さらに、様々な条件下における細胞の生存に必須となる遺伝子や、癌細胞の薬物耐性機能の発現に関与する遺伝子の同定も可能です。 GeCKOv2ライブラリーのデザインや構築に関する詳細については、こちらをご覧ください:Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047.

    GeCKO v2ライブラリーはAとB が各1/2で構成されているライブラリーで、1遺伝子当たり3個のgRNAが含まれています。両ライブラリーにはコントロールとして1000個のnon-targeting sgRNAが含まれています。また、AライブラリーにはmiRNAをターゲットとするgRNA(4 sgRNAs/miRNA)も含まれています。全ライブラリーをカバーするために両者を同時に購入して頂くことは可能ですが、その場合はより多くの細胞は必要になるため、最初はAライブラリーでのスクリーニングをお奨めします。

    ライブラリー詳細

    Library Sequence information
    Human GeCKO Library A

    65,383 sequences:

    • 3 sgRNA targeting each of 19,050 genes;
    • 4 sgRNA targeting each of 1,864 miRNA;
    • 1,000 control (non-targeting) sgRNAs.
    Human GeCKO Library B

    58,028 sequences:

    • 3 sgRNA targeting each of 19,050 genes;
    • 1,000 control (non-targeting) sgRNAs.
    Mouse GeCKO Library A

    67,405 sequences:

    • 3 sgRNA targeting each of 20,611 genes;
    • 4 sgRNA targeting each of 1,175 miRNA;
    • 1,000 control (non-targeting) sgRNAs.
    Mouse GeCKO Library B

    62,804 sequences:

    • 3 sgRNA targeting each of 20,611 genes;
    • 1,000 control (non-targeting) sgRNAs.

    GenScriptのgRNAライブラリーはIndustrialグレードとなります。ライブラリーの追加オプションなどに関しては、お問い合わせください。

    Catalog # Library Name Vectors Amount Price
    SC1771-25
    SC1771-100
    SC1771-200
    Human GeCKO Library A pLentiCRISPR v2
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1774-25
    SC1774-100
    SC1774-200
    pLentiGuide-Puro
    Accompanied by:
    pLentiCas9-Blast
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1777-25
    SC1777-100
    SC1777-200
    Human GeCKO Library B pLentiCRISPR v2
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1780-25
    SC1780-100
    SC1780-200
    pLentiGuide-Puro
    Accompanied by:
    pLentiCas9-Blast
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1783-25
    SC1783-100
    SC1783-200
    Mouse GeCKO Library A pLentiCRISPR v2
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    Out-of-Stock
    SC1843-25
    SC1843-100
    SC1843-200
    pLentiGuide-Puro
    Accompanied by:
    pLentiCas9-Blast
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1849-25
    SC1849-100
    SC1849-200
    Mouse GeCKO Library B pLentiGuide-Puro
    Accompanied by:
    pLentiCas9-Blast
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock

    GeCKOライブラリ納品物

    • 25 µgに分注された(Industrialグレード)プールライブラリーです。カタログ製品として100 µg(4 x 25 µg) および200 µg(8 x 25 µg)があり、製品にはテクニカルガイド、MSDS、COA(分析証明書)が添付されます。
    • マウスGeCKOライブラリーA (デュアルベクター): 100 µgのプールライブラリー(Researchグレード)
      • 100 µg単位で、最大900 µgまでスケールアップ可能です。Researchグレードの代わりに、Industrialグレードでも製造できます。
      • 最終プロジェクトレポートには、サンガーシークエンシングによるABIファイル、およびNGSテストによる統計概要が記載されています。ご希望に応じて、NGSの生データも提供いたします。

    GeCKOライブラリーの使用方法

    GeCKOライブラリーは、ゲノムの全遺伝子およびmiRNAをターゲットするCRISPRガイドRNAをプールしたのものです。各gRNAは、高力価ウイルスを産生するよう最適化されたレンチウイルスベクターにクローニングされ、プライマリー細胞または培養細胞株への効率的な形質導入にご利用可能です。 さらに読む »

  • CRISPR 転写活性化SAMライブラリー

    SAMライブラリーは、ゲノムワイドな機能獲得スクリーニングにおいて強力な転写活性化を誘導します。

    SAMライブラリーは、ゲノム中の各コード領域に対して強力かつ特異的な転写活性化を誘導することで、ヒト細胞での機能獲得スクリーニングが可能です。CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator(SAM)は、内在性遺伝子の転写機能を強力に活性化するように設計されたタンパク質複合体です。CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator(SAM)は、内在性遺伝子の転写機能を強力に活性化するように設計されたタンパク質複合体です。SAMは、ガイドRNAによりゲノム中の特定の座位をターゲットするCas9ヌクレアーゼの特異性とリプログラミングのしやすさを利用しています。SAM複合体は3つの転写活性化ドメイン(VP64、P65、HSF1)を含んでおり、転写開始位置の200 bp上流内の部位をターゲットし転写を活性化します。SAMシステムは、切断活性を無くしたCas9を使用しており、内在性ゲノムのDNA鎖が切断されないことを確認しています。

    ヒトのゲノムワイドSAMライブラリーは、RefSeqデータベース(23,430種のアイソフォーム)にある既知のコーディングアイソフォームすべてを活性化することができるため、遺伝子の活性化による機能獲得スクリーニングに有用です。このライブラリーは、ヒトおよびマウスの初代培養細胞、幹細胞、癌細胞、安定型発現細胞におけるスクリーニングに使用されています。SAMライブラリーを使用することにより、様々な条件下で細胞の生存に必須となる遺伝子や、癌細胞において薬剤耐性能を生じる遺伝子などを同定することが可能です。

    SAMライブラリのデザインや構築に関する詳細は、以下の文献をご覧ください。Konermann S*, Brigham MD*, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O & Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, doi:10.1038/nature14136。

    SAMライブラリーの内容物

    • 70,290種類のgRNA配列: ヒトゲノム中の23,430種のユニークコーディングアイソフォームをターゲティングする各3種のsgRNA genome。
    • Human SAM gRNA library is cloned into pLenti sgRNA(MS2)_zeoベクター骨格にクローニングされた、ヒトSAM gRNAライブラリー。
    • ライブラリーには、同時導入する必要がある、 pLenti dCas-VP64_Blast および pLenti MS2-P-HSF1_Hygro プラスミドが添付されています。

    SAMライブラリー納品物

    すべてのSAMライブラリーは Industrial グレードとなります。発注量を増やすことも可能です。ライブラリーの追加オプションなどに関しては、お問い合わせください。

    Catalog # Library Name Vectors Amount Price
    SC1770-25
    SC1770-100
    SC1770-200
    Human SAM Library
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1754-25
    SC1754-100
    SC1754-200
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock
    SC1844-25
    SC1844-100
    SC1844-200
    Mouse SAM Library
    25 µg
    100 µg
    200 µg
    In Stock

    機能獲得スクリーニングにおけるSAMライブラリーの使用法

    SAMライブラリーは、ゲノムの転写開始点に隣接する上流域をターゲットとする各種CRISPR gRNAをプールしたものです。SAMによる機能獲得遺伝子のスクリーニングには、ヒトのゲノムワイドSAM sgRNAライブラリーの他に、2種類(dCas9-VP64およびMS2-P-HSF1)のSAM複合体を組み合わせて使用する必要があります。  さらに読む »

    SAMライブラリーの構成

    SAM複合体は、3つのコンポーネントから構成されています:

    • 〇 切断活性を無くしたCas9-VP64融合物
    • 〇 テトラループとステムループに、二つのMS2 RNAアプタマーを組み込んだsgRNA
    • 〇 MS2-P65-HSF1活性化ヘルパータンパク質

    VP64、p65、HSF1の3つの異なる活性化ドメインを複合体に組み込むことで、相乗効果による強力な転写活性化を助けます。これらの3つのコンポーネントは、以下に示す通り、それぞれ別のレンチウイルスベクターにコード化されています。SAMが活性化されるには、これら3因子が同時に細胞に導入される必要があります。 ヒトのゲノムワイドなSAMガイドRNAライブラリーの配列については、csvファイルをご覧ください。

    Three components -- dCas9-VP64, sgRNA-MS2, and MS2-p-HSF1 – form the assembled SAM complex
  • パスウェイに関するCRISPR gRNAライブラリー

    パスウェイCRISPR gRNAライブラリーは、重要な特定のパスウェイのターゲットスクリーニングに最適なツールです。Drug Gene Interactionデータベースで同定された遺伝子ターゲットを使用してデザインされ、パスウェイや疾患関連遺伝子を対象にスクリーニングすることができます。全てのgRNA配列はBroad Research Instituteによって事前デザインと検証がされています。ライブラリーはIndustrialグレードで届けられ、レンチウイルスパッケージングにすぐ使用できます。ライブラリーでカバーされるgRNA配列に関する情報は、ライブラリーのハイパーリンクをクリックしてください。

謝辞

微生物ゲノム編集用のオリジナルプラスミドを提供頂いた、Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of SciencesのSheng Yang教授に感謝いたします。プラスミドは、サービスに応じてGenScriptのチームにより改変しています。

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2営業日以内ご連絡させていただきます。

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