sgRNA発現&遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9プラスミド

SpCas9ベクター

TypeII CRISPRシステムにおけるS.pyogenes（SpCas9）由来のCas9エンドヌクレアーゼは、哺乳動物のゲノム編集用として最初に開発されたCas9酵素です。ガイドRNA（gRNA）と複合体を形成することにより、Cas9酵素がゲノムの特異的部位を二本鎖切断（DSB）します。CRISPR/Cas9システムは、簡便で特異的かつ高効率であることから、ゲノム編集を迅速に行うことが可能です。弊社の野生型SpCas9複合体は、哺乳動物細胞におけるゲノム編集用に開発され、Broad Instituteにより検証されています。このシステムは、all-in-oneベクターまたはデュアルベクターの形態で使用可能で、非ウイルス性、レンチウイルス、またはアデノウィルス（AAV）の各ベクターによるトランスフェクションに対応しています。レンチウイルスベクターは、第2および第3世代いずれのレンチウイルスパッケージングプラスミドにも適合しています。

SpCas9 ニッカーゼベクター

CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の特異性は、依然として他の一般的なゲノム編集より優れていますが、オフターゲット効果については懸念が残ります。このため、特異性を改善するために、SpCas9ニッカーゼベクターではCas9のエンドヌクレアーゼ活性が変更されています。野生型Cas9に存在する2つのドメイン（RuvCとHNH）内に変異（RuvCのD10AとHNHのH840A）が導入されることによりCas9酵素が二本鎖を切断することはなく、一本鎖にニック（SSB）が入るだけになります(Ran et al, 2013)。このニッカーゼ活性を有するCas9酵素は、gRNAによりゲノムDNAターゲット部位と対峙する位置に誘導されます。細胞内で生じたSSBは、NHEJよりもHDRにより修復されるため、オフターゲットによる不測のインデル変異が生じる可能性を最小限にすることができます。弊社の哺乳動物細胞用のゲノム編集ニッカーゼベクターは、Broad Instituteにより検証されています。

SaCas9ベクター

Staphylococcus aureus由来のCas9オルソログであるSaCas9は、SpCas9よりも遺伝子サイズが約1kb短いものの、SpCas9と同様の活性を有しています。

SaCas9の主な利点は、アデノ随伴ウイルス（AAV）によるパッケージングが可能なことです。AAVの挿入可能な遺伝子サイズは約4.5kbであるため、SpCas9をこのベクターにパッケージングすることは困難です（Ran et al, 2015）。しかし、SaCas9はゲノムサイズが小さいため、AAVを用いたCRISPRによるゲノム編集が可能になります。また、この複合体は免疫原性が低いことから、SaCas9は臨床応用のゲノム編集に適していることも考えられます。

Transcription Activation（SAM）ベクター

CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator（SAM）は、内在性遺伝子の転写活性を亢進するために作製される複合体で、細胞内の10遺伝子までを同時に転写させることができます。SAMは、gRNAにより誘導されることで、内在性ゲノムDNAに対する特異的なターゲティングが可能です。弊社のSAM gRNAシークエンスは、Broad InstituteよりライセンスされたヒトゲノムDNAの全コーディング領域をターゲットとしており、その他すべての生物種についても同様にSAM gRNAがデザインされています。

カスタム合成されたSAM gRNAはレンチウイルスによって効率的にクローン化され、その後Cas9-VP64およびMS2-P65-HSF1と複合体を形成します。

SAM複合体を構成する3つの要素

• dCas9-VP64融合タンパク質：dCas9では、内在性DNA鎖は切断されません。VP64は転写活性化ドメインであり、p65およびHSF1と相乗的に作用し、転写活性を亢進します。
• テトラループおよびステムループにMS2 RNAアプタマーが組み込まれたsgRNA：理想的な転写活性化のために、SAM複合体が転写開始部位の200 bp上流に誘導されるよう、sgRNAをデザインする必要があります。sgRNAは問題なくCas9と結合しますが、MS2-P65-HSF1と結合するためにはMS2 RNAアプタマーが必要になります。
• MS2-P65-HSF1ヘルパータンパク質：P65とHSF1の2種類の転写活性化ドメインからなるタンパク質で、VP64との相乗作用によりコーディング領域の下流における転写を強力に活性化します。またMS2ドメインにより、sgRNA-Cas9複合体との結合が可能になります。

CRISPRハンドブックとプロトコール

CRISPR Handbook

CRISPRプラスミドに関するQ&A

• CRISPRプラスミドの納入仕様およびQCについて 詳細 »

納入仕様：

• 4μg凍結乾燥プラスミド
• プラスミドマップ（電子データ）

QC：

• 挿入部分を含むシークエンスデータ（電子データ）
• 品質保証書

• ターゲットノックアウトには何種類のgRNAが必要ですか？ 詳細 »

実験の精度を高めターゲットを確実にノックアウトするには、最低でも3種類のgRNAを用意することをお奨めします。同一のターゲット遺伝子に対して複数のノックアウト変異体を作ることが、オフターゲット効果に対する予防策になります。

• gRNAシークエンスのデザインについて 詳細 »

gRNAシークエンスのデザインには4つのステップがあります

1. ターゲット遺伝子ローカスの決定
2. Cas9ターゲットに最適な配列の探索
3. 潜在的オフターゲットの確認
4. 最適なgRNAシークエンスを選択

弊社のgRNAデータベースとオンラインデザインツールを使用することで、迷うことなくgRNAをデザインすることができます。

• All-in-oneベクターとデュアルベクターでは、どちらの方が良いですか？ 詳細 »

All-in-oneベクターには主要な利点が2つあります。

• 細胞へのトランスフェクションが1回のみ
• gRNAとCas9が理想的な1:1の割合で発現

デュアルベクターではgRNAとCas9が別々に発現されるため、ターゲットが複数でそれに対応する複数のgRNA発現を計画している場合に適しています。この場合、細胞内でまずCas9を発現させ、その後、gRNAベクターを導入してgRNAを発現させることにより、トランスフェクションされた細胞プールを作製します。

• レンチウイルスやアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターが必要になるのは、どういった場合ですか？ 詳細 »

CRISPRゲノム編集のベクター選択は、試験目的や細胞の種類を考慮する必要があります。

• トランスフェクションが最も容易な細胞株を使用する場合は、非ウイルス系ベクターで充分な結果が得られます。
• 初代培養細胞やトランスフェクションが困難な細胞株など、トランスフェクション効率が低い細胞株を使用する場合は、通常レンチウイルスを使用します。
• AAVベクターは免疫原性が低く、in vivoでの遺伝子導入に適しています。但し挿入できる遺伝子サイズが他のベクターより小さい（<5 kb）ため、SpCas9の遺伝子をパッケージングするのは困難です。このため、AAVの場合はSpCas9より小さいStaphylococcus aureus Cas9 orthologue (SaCas9)を使用します。

• SpCas9ニッカーゼベクターが必要になるのは、どういった場合ですか？ 詳細 »

SpCas9ニッカーゼベクターは、オフターゲットを生じ易い試料のゲノム編集に有用です。但し、DNAのフォワードおよびリバースの両鎖をターゲットとするgRNAのデザインが必要になります。これらのgRNAシークエンスは、ともにPAM部位から離れた部位がターゲットになるようにデザインされていなければなりません。それぞれのgRNAシークエンスは、最大100bpの間隔を空ける必要があります。

• 転写活性化（SAM）システムのためのgRNAシークエンスデザインはどのようにするのですか？
  詳細 »

SAM転写活性の亢進には、gRNAは転写開始点（TSS）の直上流200bpの部位をターゲットにする必要があります。転写活性のレベルを下げるには、SAM複合体がTSSのさらに上流に誘導されるようgRNAシークエンスをデザインします。転写活性を抑制するには、SAM複合体がTSSの50bp下流に誘導されるようgRNAシークエンスをデザインします。

 弊社にはゲノムワイドのSAM gRNAデータベースがあり、その中にはヒトゲノムのコーディング領域を活性化するようにデザインされた6種類のSAM gRNAが含まれています。その他の生物種についてのご相談は、弊社までご連絡下さい。  既にある日本語の人工遺伝子合成のHPの文言に寄せた場合。

CRISPR Vector Specifications